Exploring the microbial world To better protect our environment

Transfert

Tech Notes

Evaluation de kits commerciaux dits « Fast » dédiés aux analyses de qPCR 16S

La PCR quantitative ciblant le gène de l’ADNr 16S est une méthode fiable de quantification de l’abondance des communautés microbiennes (bactéries et archées). Or, de nouveaux kits commerciaux dits « Fast » permettent désormais de réaliser ces quantifications plus rapidement (environ 40-60 minutes par run contre 120-140 minutes avec les kits classiques). Les tests réalisés ont pour but d’évaluer ces kits « Fast » de plusieurs fournisseurs et de valider celui répondant à un maximum de critères déterminés (résultats cohérents, coût, praticité, reproductibilité, contact fournisseur, etc…).

Impact de la lyophilisation des sols avant extraction d’ADN sur la structure des communautés bactériennes détectée

La lyophilisation est une méthode de séchage rapide (sous vide, à une température en-dessous de 0°C) d’échantillons d’environnements, comme les sols. Cette lyophilisation permet de stabiliser les communautés présentes dans les sols, de faciliter la manipulation des sols et de traiter tous les échantillons de la même manière. Cependant, cette étape peut potentiellement biaiser les résultats obtenus par la suite. L’objectif de ce test consiste donc à déterminer si cette étape de lyophilisation entraîne ou non un impact sur la mesure de la structure des communautés bactériennes par B-ARISA.

Optimisation de l’étape de lyse mécanique du protocole d’extraction d’ADN des sols

L’extraction d’ADN des sols est une étape critique dans l’étude des communautés microbiennes. Il est indispensable que cette dernière soit la plus efficace en termes de rendement d’ADN extrait, mais aussi de reproductibilité d’une extraction à l’autre. L’optimisation décrite ici se découpe en deux étapes principales : (i) l’évaluation de deux appareils dédiés : le FastPrep-24® et le Mikro-Dismembrator S ; (ii) l’optimisation de la matrice de billes utilisée lors de cette étape de lyse. L’impact de ces différentes optimisations ont été déterminés par : la mesure de la biomasse moléculaire microbienne, des mesures d’abondance par qPCR 16S, et la détermination de la structure des communautés bactériennes par B-ARISA.

Mise au point d’un protocole de PCR « imbriquée » dédié au multiplexage de produits PCR 16S pour le séquençage massif

L’amplification de marqueurs phylogénétiques d’environnements complexes est le point de départ indispensable pour de nombreuses analyses moléculaires, comme le séquençage massif. Le multiplexage de ces produits PCRs consiste en l’ajout d’une séquence d’identification de quelques bases ou MID (Multiplex Identifier) à leur extrémité. Généralement, l’ajout de ces MIDs se fait sur les oligonucléotides utilisés durant l’étape PCR. Malheureusement, cela entraîne de nombreux effets (amplification préférentielle, sur-ou sous-représentation de communautés, etc…) indésirables. Un protocole de PCR « imbriquée » (ou nested-PCR) a donc été mis en place pour l’ajout de ces MIDs par deux étapes de PCRs successives.
PCR