Exploring the microbial world To better protect our environment

Transfert

Protocoles

Prélèvement et conditionnement des échantillons de sol pour la mise en Conservatoire

Le protocole de prélèvement d'échantillons de sol pour l'évaluation de la diversité microbienne des sols s'apparente à celui à but d'analyses physico-chimiques. Le prélèvement et le conditionnement des échantillons sont des phases critiques qui vont garantir la robustesse des analyses moléculaires et des résultats sur la caractérisation des communautés microbiennes. Les protocoles ont pour objectif de passer de quelques kilogrammes de sol issus de la zone de prélèvement à un pilulier de sol (de 50 à 100 g) destiné à la conservation en garantissant la représentativité de ce "sous-échantillon". La vidéo (en anglais) ci-après, réalisée dans le cadre du programme EcoFinders explicite ces protocoles : http://www.youtube.com/watch?v=_k7BEInBXEc

Mesure de la Biomasse Moléculaire Microbienne du sol : Extraction et quantification d’ADN du sol

La méthode de mesure de la Biomasse Moléculaire Microbienne repose sur la quantification de l’ADN microbien extrait directement à partir de l’échantillon de sol. Le protocole d’extraction est une optimisation du protocole d’extraction normalisé ISO 11063 à partir d’1 gramme de sol, permettant une amélioration de l’extraction des ADN des communautés de champignons notamment.

Purification de l’ADN du sol en vue de sa caractérisation

Le protocole s’appuie sur une double purification de l’ADN métagénomique par (i) un tamis moléculaire de PVPP et (ii) une colonne d’affinité/exclusion. Il permet d’obtenir un ADN de haute qualité moléculaire, optimal en vue de sa caractérisation.

Analyse de la Diversité des Bactéries et des Champignons : Pyroséquençage des gênes ribosomiques

La caractérisation de la diversité des communautés de bactéries et de champignons est appréhendée par pyroséquençage des gênes ribosomiques (ADNr-16S et ADNr-18S respectivement) de ces organismes. Le pyroséquençage est une technique de séquençage haut-débit qui permet de produire jusqu’à 1 million de séquences par run d’analyse avec la technologie 454 GS-FLX et donc de réaliser un inventaire taxonomique des organismes présents. Le protocole développé par la plateforme GenoSol permet la préparation, par PCR, des banques de gênes pour leur séquençage. Il est optimisé pour le séquençage de plusieurs échantillons par multiplexage (ajout de tag MID).

Mesure de la Densité des Bactéries et des Champignons : PCR quantitative des gênes ribosomiques

La méthode de mesure de la densité (nombre d’individus) des bactéries et des champignons est basée sur le dénombrement des gênes ribosomiques spécifiques des ces communautés. Ce dénombrement est réalisé par PCR en temps réel en utilisant des couples d’amorces universelles des bactéries (ADNr-16S) d’une part et des champignons (ADNr-18S) d’autre part.